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緑膿菌の低分子RNAは慢性および急性感染を制御する

Jul 15, 2023Jul 15, 2023

Nature volume 618、pages 358–364 (2023)この記事を引用

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232 オルトメトリック

メトリクスの詳細

異なるライフスタイルを切り替える能力により、細菌性病原体は多様な生態学的ニッチで繁栄することができます 1,2。 しかし、人間の宿主内での彼らのライフスタイルの変化に関する分子的な理解は不足しています。 今回、ヒト由来のサンプルにおける細菌の遺伝子発現を直接調べることにより、日和見病原体緑膿菌の慢性感染と急性感染の間の移行を調整する遺伝子を発見しました。 ここでは sicX と名付けられたこの遺伝子の発現レベルは、ヒトの慢性創傷および嚢胞性線維症感染症で発現される緑膿菌遺伝子の中で最も高いものですが、標準的な実験室での増殖中は極めて低いレベルで発現されます。 我々は、sicXが、低酸素条件によって強く誘導され、嫌気性ユビキノン生合成を転写後に調節する低分子RNAをコードしていることを示す。 sicX の欠失により、複数の哺乳動物感染モデルにおいて緑膿菌が慢性的なライフスタイルから急性的なライフスタイルに切り替わります。 注目すべきことに、sicXは、慢性感染が分散して急性敗血症を引き起こすときに最も下方制御される遺伝子であるため、この慢性から急性への移行のバイオマーカーでもある。 この研究は、緑膿菌の慢性から急性へのスイッチの根底にある分子基盤に関する数十年来の疑問を解決し、酸素が急性致死性の主な環境要因であることを示唆しています。

多くの病原性細菌は宿主に定着し、慢性的に存続する可能性があります。 場合によっては、細菌が最初の感染部位から体の他の部分に広がり、急性の全身疾患を引き起こします。 生物学における中心的な問題は、このライフスタイルの切り替えを制御する分子機構と環境の手がかりを理解することです。 日和見性ヒト病原体緑膿菌は、治療が難しいことで知られる急性感染症と慢性感染症の両方を引き起こす可能性があります。 緑膿菌は、単細胞 (浮遊性ライフスタイル) またはマトリックスに囲まれた凝集体 (バイオフィルム ライフスタイル) として存在し、それぞれ急性感染症と慢性感染症に有利に働くと考えられています。 したがって、実験室研究は伝統的に、人間におけるこの病原体のライフスタイルの変化を理解することを目的として、in vitroでの緑膿菌のバイオフィルムとプランクトンの移行を調べることに焦点を当ててきました。 数十年にわたる研究により、セカンドメッセンジャー環状ジGMP3、4、5やGac-Rsmシステム2、6、7、8、9、10、11、12などのグローバルな調節システムが、Pのバイオフィルムからプランクトンへの移行をどのように制御するのかが示されている。この細菌の生活史について重要な洞察を提供します。 しかし、これまでのところ、緑膿菌が環境の合図にどのように反応し、それに応じて哺乳動物宿主内での感染ライフスタイルを切り替えるのかは依然として解明されていない。 この研究では、ヒト由来のサンプルから取得した緑膿菌トランスクリプトームを活用して、緑膿菌の慢性感染を支配する慢性感染症 X (SicX) の sRNA インデューサーと呼ばれる新しい低分子 RNA を発見し、機構的に特徴付けることで、この知識のギャップに対処しました。または哺乳動物感染時の緊急決定。

我々は以前、嚢胞性線維症患者の喀痰サンプルや慢性創傷患者のデブリードマンサンプルなど、ヒト感染サンプルから高解像度の緑膿菌トランスクリプトームを取得しました13,14。 私たちは、機械学習手法を使用して、ヒトにおける緑膿菌の増殖と実験室での緑膿菌の増殖を区別する発現レベルを集合的に区別する 30 個の緑膿菌遺伝子を特定しました 13。 これらの遺伝子の半分以上は特性が解明されておらず、緑膿菌のヒト感染生物学に関する知識に大きなギャップがあることが浮き彫りになっています。 これらの機能不明遺伝子には PA1414 (緑膿菌 PAO1 株の遺伝子座タグ) が含まれており、ヒトでの発現レベルは実験室での発現レベルよりも 222 倍高く、その発現レベルは発現している緑膿菌遺伝子の中で最も高いです。ヒト感染時（図1a）。 次に、PA1414 転写物の相対存在量（100 万あたりの転写数（TPM））を、他のタンパク質コード（5,893 遺伝子）および非コード（199 sRNA）転写物と比較しました（図 1b）。 平均して、PA1414 転写物はヒト慢性感染サンプルから取得した緑膿菌トランスクリプトームの TPM の 13.85% を占め、特に場合によっては総 TPM のほぼ 50% を構成していました。 しかし、標準的なインビトロ条件下で増殖させた緑膿菌では、PA1414 発現レベルは非常に低かった。 PA1414 は機能が不明な小さな遺伝子 (長さ 234 塩基対) です。 261の完全な緑膿菌ゲノムの検査により、258のPA1414オルソログが同定されました（図1cおよび拡張データ図1）が、他のシュードモナス種または他の生物ではホモログは同定されませんでした。 上流プロモーター領域を含むPA1414オルソログのDNA配列は高度に保存されており（図1d）、PA1414には保存された機能があり、その発現制御は緑膿菌分離株全体で普遍的であることが示唆されています。

2, |log2[fold change]| > 1) for identifying differentially expressed genes. The upregulated (green) and downregulated (blue) genes in humans are colour-coded differently. Grey bubbles indicate genes that are not differentially expressed. b, Relative transcript abundance (TPM) of PA1414 compared to those of all other protein-coding sequences (CDSs) and non-coding sRNAs in 54 transcriptomes examined in a, sorted from the highest to the lowest PA1414 TPM. Average PA1414 TPM is indicated with dashed lines. c, PA1414 orthologues are found only in P. aeruginosa. Green and black bars indicate the presence and absence of orthologues, respectively. d, DNA sequence conservation of PA1414 and its neighbouring genes among 258 PA1414-containing P. aeruginosa isolates. Below, the percentage of orthologues identical to the PA1414 allele from PA14 at each nucleotide is shown./p> 103, PA1414 ranking < 102) for identifying transcriptomes with high PA1414 expression. b, β-galactosidase assay examining the induction of PA1414 under anaerobic and static conditions. PPA1414-lacZ, lacZ transcriptionally fused to PA1414 promoter; PPA1414*, PA1414 promoter containing mutations in the Anr-binding motif; MrT7, MAR2xT7 transposon. n ≥ 4 independent experiments. c, Northern blot analysis of PA1414 expression. Estimated size (nucleotides, nt) are indicated on the left. 5S rRNA served as a loading control. For gel source data, see Supplementary Fig. 1. d, Colony biofilm growth of ΔPA1414 and WT in different P. aeruginosa strain backgrounds. The presence and absence of oxygen are indicated. The CFU of ΔPA1414 was normalized against the CFU of the WT in each experiment (n = 4). A dashed line highlights the point where the CFU ratio = 1. e, Percentage of tetracycline-resistant (TetR) cells before and after daily passages under anaerobic conditions (n = 3). TetS, tetracycline sensitive; Δ, ΔPA1414. f, RNA-seq reads aligned to the PA1414 locus during standard in vitro growth and human infections. Blue shade indicates Rho-independent terminator in PA1414. g, Colony biofilm growth of ΔsicX harbouring different sicX mutations under anaerobic conditions. n = 4 independent experiments. h, Comparative proteomic study identifies the targets of SicX under both static and anaerobic conditions. i, β-galactosidase assay evaluating the translational control of SicX on ubiUVT under anaerobic conditions (n ≥ 4). j, β-galactosidase assay evaluating the transcription of ubiUVT in the absence of SicX or Anr under static conditions (n ≥ 8). k, Quantification of anaerobic UQ9 synthesis in different strains (n = 4). l, A model of dual regulation of ubiUVT expression by Anr and SicX. Error bars represent standard deviation from the mean. Significant differences (compared to the WT) are indicated with asterisks (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001; two-tailed Mann–Whitney test)./p>108 colony-forming units (CFUs) g−1; Fig. 3c). However, among mice carrying a high wound burden (>108 CFUs g−1), ΔsicX caused more systemic infection (12 out of 15) compared to WT (2 out of 11), indicating that dissemination did not solely depend on the wound burden (two-tailed Fisher’s exact test, P = 0.0043; Fig. 3c). Moreover, these observations are not due to differential fitness of WT and ΔsicX in spleens. This was demonstrated using an acute skin infection model in which systemic infection occurs shortly after subcutaneous injection into the mouse inner thigh. In this model, WT and ΔsicX exhibited similar colonization and growth in spleens (Extended Data Fig. 6). Taken together, our data indicate that SicX is a key player in P. aeruginosa chronic infection, the high expression of which promotes chronic localized infection./p>90% and query coverage values of >90% were retained for further analysis. Sequences of sicX and ubiUVT orthologues were aligned using MUSCLE43. To analyse the sequence conservation of sicX and ubiUVT orthologues, we first aligned sicX and ubiUVT orthologues using MUSCLE. Next, alignment ends were trimmed and gaps were removed, and percentages of orthologue sequences that are identical to sicX and ubiUVT queries were calculated at each nucleotide position in R. To create Extended Data Fig. 4b,c, the alignments were visualized in Jalview44 using the default nucleotide colour scheme./p>

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